Лабораторная работа к теме №5

Исследование 17. Фотосенсибилизирующее действие хлорофилла на реакцию переноса водорода (по Гуревич)

Теоретические основы исследования

Сущность световой фазы фотосинтеза заключается в окислении воды до молекулярного кислорода с помощью световой энергии, поглощенной хлорофиллом. Освобождающиеся при этом электроны передаются затем через цепь промежуточных переносчиков к НАДФ, который восстанавливается до НАДФ-Н2. Кроме того, при переносе электронов часть энергии расходуется на образование АТФ, т. е. фотосинтетическое фосфорилирование.

Считают, что в переносе электронов воды к НАДФ участвуют последовательно две пигментные системы, которые содержат различные формы хлорофилла а, отличающиеся максимумами поглощения в длинноволновой части спектра. В первую систему входят также каротиноиды, а во вторую- хлорофилл b и ряд других вспомогательных пигментов.

Итак, конечный результат фотоокисления воды - выделение молекулярного кислорода и образование богатых энергией и восстановительной силой соединений - АТФ и НАДФ-Н₂, необходимых для последующего восстановления углекислого газа.

Упрощенную схему фотолиза воды можно представить следующим образом:

Как видно из уравнения, хлорофилл выполняет здесь функцию - фотосенсибилизатора, способствующего переносу электрона (водорода) к НАДФ.

Фотосенсибилизирующая роль хлорофилла может быть продемонстрирована в модельных реакциях с выделенным из растений пигментом. Для этого в качестве источника водорода берут аскорбиновую кислоту, а акцептора водорода - метиловый красный, который, присоединяя водород, восстанавливается в неокрашенное лейкосоединение. Аскорбиновая кислота окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту по схеме:

где АН₂ - донор электронов (аскорбиновая кислота);

М - акцептор электронов (метиловый красный);

А - дегидроаскорбиновая кислота;

МН₂ - бесцветная лейкоформа метиловый красный.

Цель исследования: установить роль хлорофилла как фотосенсибилизатора в процессах переноса электронов к НАДФ+.

Объекты исследования, реактивы, оборудование:

Объекты исследования - спиртовая вытяжка из листьев амариллиса, плюща или других растений.

Реактивы: 85 %-ый этиловый спирт, СаСО3, аскорбиновая кислота (кристаллическая), метиловый красный (насыщенный раствор в этиловом спирте), раствор хлорофилла (спиртовая вытяжка из листьев).

Оборудование - пробочные сверла 08-10 мм, ножницы, колбы на 100 мл (2 шт.), воронки 0 5 см (2 шт.), стеклянная палочка длиной 8-12 см, бумажные фильтры кварцевый песок или толченое стекло, вазелин, колба Бунзена, стеклянный фильтр № 2 или № 3, насос Камовского или водоструйный, градуированные пипетки на 10 мл и на 1 мл, средние пробирки, штатив, электрическая настольная лампа на 300 Вт., стеклянный сосуд с плоскопараллельными стенками.

Схема исследований:

1. Вытяжка хлорофилла + аскорбиновая кислота + метиловый красный + свет (контрольный вариант).

2. Вытяжка хлорофилла + аскорбиновая кислота + метиловый красный + темнота.

3. Вытяжка хлорофилла + метиловый красный + свет.

4. Спирт + аскорбиновая кислота + метиловый красный.

Методика исследований

А. Получение спиртового раствора (вытяжки) пигментов зеленого листа

Из листьев растений (не затрагивая крупных жилок) пробочным сверлом вырезают диски. Из них составляют навеску в 1,0-1,5 г. Для расчета поверхности листьев взятой пробы необходимо сосчитать количество дисков и измерить их диаметр.

Навеску листьев переносят в фарфоровую ступку и растирают с небольшим количеством этилового спирта, прибавив предварительно на кончике ножа СаСОз (для нейтрализации кислот клеточного сока) и чистого кварцевого песка (для лучшего растирания). Носик ступки с наружной стороны смазывают вазелином. После небольшого отстаивания зеленый раствор осторожно (чтобы не потерять ни капли раствора) по палочке сливают в воронку с пористым стеклянным фильтром. С помощью масляного или водоструйного насоса фильтруют вытяжку в колбу Бунзена. Оставшуюся в ступке густую массу снова растирают со спиртом. После отстаивания жидкость переносят на фильтр.

Эту операцию повторяют несколько раз, пока раствор, стекающий из воронки, не будет бесцветен. Переносят спиртовую вытяжку из колбы Бунзена в мерную колбу на 25-50 мл, спиртом доливают до метки и перемешивают. Полученный зеленый раствор содержит следующие пигменты.

1. Зеленые:

хлорофилл «a» C₃₂H₃₀ON₄Mg (COOCH3) (СООС₂₀Н₃₉);

хлорофилл «б» C₃₂H₂₈O₂N₄Mg (СООСНз) (СООС_2оН₃₉).

2. Желтые:

каротин С_4оН_5б; ксантофилл С_4оН_5бО₂.

С полученной вытяжкой производят ряд исследований и определяют количество хлорофилла в ней.

Б. Изучение фотосенсибилизирующих действий хлорофилла на реакцию переноса водорода по Гуревичу.

Берут четыре пробирки: в первые три наливают по 5 мл спиртовой вытяжки хлорофилла, в четвертую - 5 мл этилового спирта. В первую, вторую и четвертую пробирки вносят приблизительно по 50 мг кристаллической аскорбиновой кислоты и несколько раз хорошо встряхивают раствор. Во все пробирки с хлорофиллом прибавляют по каплям отфильтрованный спиртовой раствор метилового красного до тех пор, пока зеленая окраска не перейдет в красно-бурый цвет. В четвертой пробирке спирт доводят с помощью индикатора до ярко-розовой окраски. Вторую пробирку закрывают чехлом из черной бумаги, а затем все пробирки ставят в штатив и освещают электрической лампой (300 Вт), расположив ее на расстоянии примерно 15 см от штатива. Для поглощения тепловых лучей между пробирками и источником освещения желательно поместить заполненный водой сосуд с плоскопараллельными стенками.

После 10-15-минутного освещения в первой пробирке вследствие восстановления метиловый красный обесцвечивается, и раствор вновь приобретает зеленую окраску. В опытных пробирках окраска раствора не изменяется, так как в отсутствие света, аскорбиновой кислоты или хлорофилла метиловый красный не восстанавливается лейкосоединение.

Исследование можно продолжить и установить зависимость фотосенсибилизирующего действия хлорофилла от интенсивности света и его спектрального состава. Результаты исследований занести в таблицу 23.

23. Влияние света на фотосенсибилизирующее действие хлорофилла

	Состав смеси в пробирках
№ п/п	хлоро	эти	кристалли	Насыщенный	Усло	Результаты
	филл (мл).	ловый спирт	ческая аскорбиновая	спиртовой раствор метилов	вия опыта	(окраска вытяжки)
		(мл)	кислота (мг)	го красного
	5	-	50	Добавляется	Свет
	5	-	50	до появления	Тем-
				красно-бурой	нота
	5	-	-	окраски	Свет
	-	5	50		Свет	|

На основе анализа результатов табл. 23 делают выводы.

Исследование 18. Изучение состава пигментов листа и их оптических свойств в зависимости от центра происхождения растений

Теоретические основы исследования

Французские химики П.Ж. Пельтье и Ж. Каванту в 1817г. выделили из листьев зеленый пигмент и назвали его хлорофиллом (chloros - зеленый и phyllon - лист), который, как выяснилось позднее, локализован в хлоропластах.

Русский ученый М.С. Цвет (1901 - 1903) установил, что вытяжка из листа под «символом» хлорофилл неоднородна, а группа пигментов, являющихся необходимыми компонентами фотосинтезирующих систем.

Пигменты - это соединения, избирательно поглощающие свет в видимой части солнечного спектра.

При освещении белым светом их окраска определяется теми лучами, которые они отражают или пропускают. Поглощение пигментами световой энергии обусловлено наличием в их молекуле хромофорных групп. Хромофорные группы, представляющие собой систему сопряженных двойных связей, содержат большое число легко возбуждаемых светом π-электронов. Для их перехода в возбужденное состояние достаточно энергии квантов видимой области спектра. Все пигменты фотосинтезирующих организмов обычно подразделяют на три группы: хлорофиллы, фикобилипротеины (пигменты тетрапиррольной природы) и каротиноиды.

У всех эукариотных растений пигменты локализованы в хлоропластах - органоидах клетки, являющихся центрами превращения солнечной энергии. У прокариотных водорослей и фотосинтезирующих бактерий хлоропластов нет. Пигменты, принимающие участие в фотосинтезе, локализованы у них в мембранных структурах тилакоидах и ламеллах.

Хлорофиллы. Все фотосинтезирующие организмы содержат эти зеленые пигменты. По своей природе хлорофиллы являются Mg-порфиринами. Центральным атомом, связывающим четыре пирролъных кольца (I-IV), служит Mg. В результате образуется большое порфириновое кольцо с сопряженными по кругу двойными связями. Чередующиеся одинарные и двойные связи включают делокализованные π- электроны, которые принимают участие в поглощении света. Кроме того, в структуре хлорофилла имеется одно I циклопентановое кольцо (V), которое имеет кетогруппу высокой химической активности. Последняя участвует в образовании ассоциатов молекул хлорофилла и комплексов пигмента с молекулами воды.

Длинная углеводородная цепь (остаток фитола), присоединенная к порфириновой части молекулы хлорофилла, обладает липофильными свойствами. Фитольный остаток служит своего рода неполярным якорем, с помощью которого молекулы хлорофилла взаимодействуют с гидрофобными зонами белков. Все это имеет значение для создания определенной пространственной ориентации молекул хлорофилла и поддержания структуры хлоропластов.

В настоящее время известно около десяти пигментов, входящих в группу хлорофиллов и отличающихся друг от друга некоторыми структурными особенностями. Наиболее распространены среди них хлорофиллы а, в и бактериохлорофилл а.

Хлорофилл а входит в состав пигментного аппарата всех фототрофов, кроме фотосинтезирующих бактерий, содержащих бактериохлорофилл а. Хлорофилл в, который находится в хлоропластах высших растений и в зеленых водорослях, отличается от хлорофилла а тем, что вместо - СНз-группы у 3-го углеродного атома (в II кольце) имеется - СОН-группа (рис. 27):

Порфириновое кольцо хлорофилла поглощает красные и сине-фиолетовые лучи, пропуская значительную часть зеленых. Этим объясняется зеленый цвет хлорофилла. Именно молекулы хлорофилла а (у растений) и бактериохлорофилла а (у фотосинтезирующих бактерий) являются теми пигментами, которые непосредственно входят в реакционный центр фотосинтеза и принимают участие в преобразовании световой энергии. Остальные хлорофиллы служат «антеннами». Они поглощают энергию света и передают ее к хлорофиллу а или бактериохлорофиллу а.

Цель исследования: изучить методику разделения пигментов листа и их оптические свойства.

Объекты исследования, реактивы, оборудование

Объекты исследования - листья амариллиса, традесканции, пеларгонии.

Реактивы - этиловый спирт, бензин (бесцветный), 80% ацетон, петролейный эфир, CaCО₃

Рис. 27. Спектры поглощения хлорофиллов а и b в эфире: 1 -хлорофилл а, 2 - хлорофилл в

Оборудование - большая пробирка или цилиндр высотой 20-25 см с плотно закрывающейся корковой пробкой, имеющая на нижней стороне небольшой крючок, цветные фломастеры.

Схема исследования

1 .Изучение оптических свойств пигментов листа амариллиса.

2. Изучение оптических свойств пигментов листа традесканции.

3.Изучение оптических свойств листа бегонии.

1. Определение флуоресценции хлорофилла у разных видов растений.

Теоретические основы флуоресценции

Флуоресценция представляет собой свечение веществ при поглощении ими света. Флуоресценция хлорофилла, не являясь фотосинтетически утилизируемой формой энергии, служит признаком его фотохимической активности.

В темноте молекула хлорофилла находится в основном состоянии с наиболее низким энергетическим уровнем валентных электронов. При поглощении кванта света один из π-электронов молекулы хлорофилла переходит на более высокий энергетический уровень, в результате чего возникает электронно-возбужденное состояние молекулы. При возвращении из возбужденного состояния в основное энергия электронов может расходоваться на: 1) фотохимическую работу; 2) возбуждение соседних молекул хлорофилла; 3) потерю в виде тепла; 4) флуоресцентное излучение. Независимо от длины волны возбуждающего света спектр флуоресценции хлорофилла а имеет максимум при 670 нм. Хлорофилл сильно флуоресцирует в растворах и слабо - в листьях, что объясняется плотной упаковкой молекул в тилакоидах и использованием поглощенной энергии в фотохимических процессах. Методика исследования

Вытяжку пигментов в конической колбе или пробирке поместить на темном фоне у настольной лампы или осветить пучком света проекционного фонаря. Рассмотреть вытяжку с той стороны, откуда падает свет.

Отметить окраску раствора и сделать вывод о причине флуоресценции.

Явление флуоресценции можно наблюдать и на живых растениях. Удобными объектами для этих целей являются водоросли, водяной мох (Fontinalis), Elodea densa и другие растения.

Растительный объект помещают на предметное стекло микроскопа и освещают его сине-фиолетовыми лучами. Для этого между осветителем и зеркалом микроскопа помещают синее стекло. Под влиянием этого облучения содержащие хлорофилл пластиды начитают светиться красным светом.

2. Изучение спектра поглощения пигментов вытяжки Спектроскоп и работа с ним

Фотосинтез в зеленых растениях происходит благодаря поглощению хлорофиллом лучей (спектра) солнечного света. Чтобы определить, какие лучи поглощаются хлорофиллом, используют спектроскоп.

Для изучения спектра поглощения растворов широко применяется спектроскоп системы Кирхгофа-Бунзена (рис. 28).

Спектроскоп состоит из коллиматорной трубы 1, имеющей на одном конце узкую щель 2, на другом - линзу 3; призмы 4, зрительной трубы 5 с линзой 6 на одном конце и с окуляром, через который ведется наблюдение, на другом конце; ширину щели регулируют винтом 7.

Методика исследования

Свет от источника излучения, проходя через щель коллиматора, попадает на линзу, а потом на призму. Призмой он разлагается на пучки лучей различных цветов. В фокальной плоскости второй линзы получается ряд параллельных различно окрашенных изображений щели, которые рассматриваются через окуляр зрительной трубы.

Помещая на пути лучей света, дающих сплошной спектр, раствор окрашенного вещества, получают на фоне сплошного спектра темные полосы или отдельные линии, соответствующие тем участкам спектра, которые поглощены раствором.

В некоторых спектроскопах имеется еще труба 8 с объективом 9 и специальной шкалой 10 для установления положения полос поглощения по длинам волн. Шкала эта освещается при помощи маленького зеркальца 11.

До начала работы со спектроскопом устанавливают источник света и регулируют с помощью винта ширину щели на коллиматорной трубе. Щель должна быть не слишком большой и не слишком малой. В первом случае спектр получается яркий, но размытый, во втором - недостаточно освещенный. Более яркий спектр можно получить, если перед щелью коллиматора, на его оси поместить собирательную линзу 12.

Если в спектроскопе имеется шкала длин волн, то надо ее установить так, чтобы ее изображение правильно накладывалось на спектр.

Рис. 28. Спектроскоп: а - общий вид, б - оптическая схема. 1 - коллиматорная труба; 2 - щель; 3,6 - линзы; 4 - призма; 5 - зрительная труба; 7 - винт; 8 - труба со шкалой; 9 - объектив; 10 - шкала длин волн; 11 -зеркальце; 12 - собирательная линза; 13 - винт климальеры с делениями

После того как спектроскоп установлен, приступают к определению спектра поглощения окрашенного раствора. Задвиганием и выдвиганием окуляра зрительной трубы 5 достигают ясного изображения спектра. Сначала наблюдают спектр используемого источника света (электрическая лампа, естественный свет) (зарисовать его), затем перед щелью помещают пробирку (лучше кювету с плоскопараллельными стенками) с исследуемым раствором, зарисовывают спектр и отмечают положение темных полос в спектре. Эти полосы соответствуют участкам спектра, которые поглощаются данным раствором.

Определение спектра поглощения хлорофилла с целью определения спектра поглощения хлорофилла установить спектроскоп по отношению света так, чтобы все области спектра имели одинаковую яркость. В кювету наливают спиртовую вытяжку хлорофилла, помещают ее перед щелью спектроскопа и определяют положение темных полос, которые соответствуют лучам, поглощаемым хлорофиллом.

Ширина полос зависит от концентрации пигмента или толщины слоя его раствора. Ширину полос замеряют на климальере (13) и заносят в табл. 24. Для наблюдения спектров поглощения растворов с разной концентрацией хлорофилла разбавляют вытяжку спиртом в отношениях 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и т. д. и исследуют оптические свойства полученных растворов. По окончании опыта делают заключение о зависимости спектра поглощения хлорофилла от его концентрации и объясняют установленный факт.

Определение спектра поглощения ксантофилла

Для определения спектра поглощения ксантофилла последний необходимо выделить из общей вытяжки. Для этого используют метод Крауса.

Этот метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине.

В узкую плоскодонную пробирку наливают 2-3 мл спиртовой вытяжки, прибавляют примерно полуторный объем бензина и 5-6 капель воды, для того чтобы спирт не смешивался с бензином. Пробирку закрывают и несколько раз сильно встряхивают, а затем дают 2-3 мин постоять. При этом происходит разделение слоев: верхний зеленый слой (бензиновый) содержит оба зеленых пигмента и каротин, а желтый нижний слой (спиртовой) содержит ксантофилл. Определяют спектр поглощения ксантофилла. О чистоте отделения ксантофилла от других пигментов судят по спектру поглощения: ксантофилл не поглощает красных лучей.

Результаты заносят в табл. 24.

Выделение из спиртовой вытяжки каротина и определение его спектра поглощения

В пробирку с 2-3 мл вытяжки прибавляют несколько капель 20%-ного спиртового раствора щелочи. Наливают 1-1,5 мл бензина и две капли дистиллированной воды. Сильно встряхивают, а затем дают отстояться. Нижний спиртовой слой содержит соль хлорофиллиновой кислоты (продукт омыления хлорофилла) и ксантофилл. Верхний бензиновый слой - каротин. Определяют спектр поглощения каротина.

Результаты исследования заносят в табл. 24 и делают выводы.

24. Спектры поглощения пигментами листа света

№	Пигменты	Спектр света*							Ширина полосы по климальере (деления)
		К	О	Ж	3	Г	С	Ф
I	Амариллис, пигменты:	+
	1 . Хлорофиллы
	2. Ксантофилл
	3 . Каротин
I I	Традесканция, пигменты

· - крестиком или полосой отмечают спектр поглощения.

· ** начальные буквы спектра света.

Разделение пигментов методом хроматографии на бумаге (демонстрационное)

Теоретические основы исследования

Пигментный аппарат фотосинтезирующих организмов может быть качественно охарактеризован использованием метода хроматографии, который впервые предложил русский ученый М.С. Цвет.

Разделение смеси пигментов на отдельные компоненты проводится с помощью хроматографии на различных носителях-адсорбентах (бумага, сахароза, силикагель, силуфол и др.). Чтобы пигменты разделились на сорбентах, используют систему неполярных растворителей с примесью определенного количества полярного растворителя. Пигменты, обладая неодинаковой растворимостью в данном растворителе и разной способностью к адсорбции, передвигаются по мере движения растворителя с различной скоростью и располагаются на адсорбенте отдельными зонами. Чем больше растворимость пигмента в растворителе и чем хуже он адсорбируется данным адсорбентом, тем быстрее этот пигмент будет передвигаться и тем дальше от старта будет располагаться зона этого пигмента.

Методика разделения пигментов

1. На вырезанной полосе (2 х 13-15 см) из фильтровальной, а лучше из хроматографической бумаги на расстоянии 1-1,5 см от узкого края делают черту простым карандашом. Наливают вытяжку в небольшой сосудик и погружают в нее полоску на глубину 3-5 мм.

Как только вытяжка по полоске поднимется до метки (1-1,5 см) полоску вынимают и сушат на воздухе и снова погружают ее в раствор пигментов на несколько секунд. Эту операцию повторять 5-7 раз до тех пор, пока у верхней границы распространения пигментов на бумаге не образуется темно-зеленая полоска. После этого погрузить конник бумажной полоски на несколько секунд в чистый ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1-1,5 см.

Высушив полоску до полного исчезновения запаха ацетона, поместить ее в вертикальном положении в цилиндр, на дно которого налит петролейный эфир. Полоску нужно подвесить на крючок так, чтобы в растворитель был погружен только неокрашенный конец и чтобы она не касалась стенок сосуда. В связи с тем, что пигменты разрушаются на свету, разделение следует проводить в темноте или при слабом освещении.

Через 10-15 мин растворитель поднимется на 10-12см. При этом пигменты расположатся в следующем порядке: внизу хлорофилл в, над ним хлорофилл а, затем ксантофилл и выше всех каротин, поднимающийся вместе с фронтом растворителя (рис. 29).

Зарисовать полученную на полоске хроматограмму и сделать вывод о причинах разделения пигментов на бумаге.

2. На круглом обеззоленном химическом фильтре сделать по paдиусу два надреза, не доходя до центра, и полученный «язычок» I немного отогнуть вниз. В центр с помощью пипетки нанести стартовое пятно пигментов и следить, чтобы оно не расплывалось. Пятно должно иметь интенсивно зеленый цвет, что достигается 2-3-кратным нанесением вытяжки. Затем просушить хроматограмму, положить ее на края чашки Петри, куда налит слой бензина (0,5 см), опустить «язычок» в растворитель и плотно закрыть чашку крышкой.

Рис. 29. Хроматографическое разделение пигментов зеленого листа:

а - в пробирке: 1- растворитель, 2 - стартовая полоса, 3 - хлорофилл в, 4 - хлорофилл а, 5 - ксантофилл, 6 - каротин б - в чашке Петри: 1- чашка с растворителем; 2 - кружок фильтровальной бумаги; 3 - крышка чашки Петри; 4 - положение стартового пятна; 5 - зоны пигментов после разгонки

На хроматограмме пигменты будут расположены концентрическими кругами со стартовым пятном в центре (рис. 29, б) На хроматограммах, полученных двумя способами, пигменты располагаются в одинаковом порядке. Слабо-зеленая зона, которая иногда наблюдается на месте стартовой полосы или пятна, представляет собой хлорофиллид - бесфитольное производное хлорофилла, нерастворимое в бензине. Непосредственно над стартовой полосой находится хлорофилл б желтовато-зеленого цвета, над ним - хлорофилл а, голубовато-зеленого цвета. Далее следуют ксантофиллы, не разделяющиеся на отдельные компоненты при данном способе хроматографии, а затем с фронтом растворителя - каротины. Сделать выводы о пигментах разных растений.

Исследование 19. Химические свойства хлорофилла

Теоретические основы исследования

По химической природе хлорофиллы а и в-сложные эфиры дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов - метилового и одноатомного непредельного спирта фитола. Поэтому их можно определить как фитилметилхлрофиллиды:

Обрабатывая хлорофилл щелочью, можно вызвать омыление эфирных групп, т. е. отщепление остатков метилового спирта и фитола:

При этом образуется соль хлорофиллиновой кислоты. Она отличается большей гидрофильностью по сравнению с неизмененным пигментом и сохраняет зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла.

Как уже отмечалось ранее, хлорофиллы относятся к магний-порфиринам. Атом магния сравнительно слабо удерживается в порфириновом ядре и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами, что приводит к образованию феофитина бурого цвета:

Если на феофитин подействовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов водорода в ядро входит соответствующий металл, и окраска вновь изменяется:

Обратное введение магния в феофитин происходит с большим трудом.

Цель исследования: установить зависимость окраски и спектральных свойств хлорофилла от компонентов (спиртов - метилового, фитола и металла - Mg), входящих в структуру его молекулы.

Объект исследования, реактивы, оборудование:

Объект исследования - спиртовая вытяжка хлорофилла.

Реактивы - этиловый спирт, 20 % NaOH или КОН, 10%-ная соляная кислота в капельнице, уксуснокислая медь.

Оборудование - коническая колба с обратным холодильником, водяная баня, штатив с пробирками, пипетка на 1 мл, конические колбочки, цветные карандаши.

Схема исследования

1. Вытяжка хлорофилла, ее окраска, спектр поглощения.

2. Отщепление спиртов посредством омыления хлорофилла щелочью. Окраска вытяжки, спектр поглощения.

3. Замещение в молекуле хлорофилла атома Mg++ на атомы Н+ получение феофитина. Окраска вытяжки, спектр поглощения.

4. Замещение в феофитине атомов Н+ на атом Сu+. Окраска вытяжки, спектр поглощения.

Методика исследования

Отщепление (омыление) от хлорофилла спиртов щелочью

В пробирку с 2-3 мл спиртового раствора пигментов приливают 1мл 20 %-ный NaOH и взбалтывают. После смешивания экстракта со щелочью пробирку помещают в кипящую водяную баню. Как только раствор закипит, пробирку вынимают и охлаждают. К охлажденному раствору добавляют равный объем бензина и несколько капель воды для лучшего разделения смеси. Затем содержимое пробирки резко встряхивают и дают ему отстояться.

В бензиновый слой перейдут каротин и ксантофилл, а в спиртовой раствор - натриевая соль хлорофиллиновой кислоты.

По окончании опыта зарисовывают окраску слоев, указав распределение пигментов, снимают спектр поглощения.

Результаты и исследования заносят в табл. 25.

Влияние ликвидации (получение феофитина) и восстановление металлоорганической связи в молекуле хлорофилла на ее окраску и оптические свойства.

Ход работы. В две пробирки берут по 2-3 мл спиртовой вытяжки пигментов и прибавляют по 1-2 капли 10 %-ной соляной кислоты. При взбалтывании зеленая окраска хлорофилла изменится на характерную для феофитина. Далее одну пробирку с феофитином оставляют для контроля, а во вторую вносят несколько кристалликов уксуснокислой меди и раствор нагревают на водяной бане до кипения. После нагревания бурый цвет раствора меняется вследствие образования хлорофиллоподобного производного меди (снять спектр поглощения).

Необходимо зарисовывать окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла.

Результаты исследования заносят в табл. 25 и отвечают на вопрос: «Отчего зависит зеленая окраска хлорофилла?». 25. Окраска и спектр поглощения хлорофилловой кислоты, феофитина и хлорофиллоподобного производного меди

Варианты	Спектр поглощения							Окраска
	К	О	Ж	3	Г	С	Ф
Вытяжка хлорофилла
Хлорофиллиновой кислоты
Феофитина
Хлорофиллоподобного производного меди

На основе данных табл. 25 письменно в тетради делают выводы. Исследование 20. Количественное определение пигментов Теоретические основы исследования

Хлорофилл и каротиноиды - важнейшие компоненты фотосинтетического аппарата листьев. Количественное их содержание в листьях зависит от жизнедеятельности организма, его генетической природы. Поэтому оно может быть использовано как физиологический показатель, характеризующий онтогенетические, возрастные и генетические особенности растений. Количество пигментов отражает и реакцию растительного организма на условия произрастания. Следовательно, при физиологических исследованиях часто возникает необходимость проследить за динамикой содержания хлорофилла и каротиноидов в отдельных органах.

Пигменты лучше всего экстрагировать из свежего растительного материала, но можно и из сухих листьев. В последнем случае надежным способом фиксации служит замораживание тканей с последующей лиофилизацией (лиофильная сушка). Недопустимо фиксирование растительного материала сухим жаром в сушильном шкафу, поскольку постепенное повышение температуры сопровождается усилением гидролитических процессов, и в том числе гидролиза хлорофилла. Фиксированные листья помещают в эксикатор и хранят в темном и прохладном месте. При работе с сухим материалом берут 80 %-ный раствор ацетона или 90 %-этилового спирта.

Цель исследования: определить содержание хлорофилла в листьях растений разных экологических групп.

Объекты исследования, реактивы, оборудование.

Объекты исследования - а) листья выгонки лука или амариллиса;

б) пеларгония зональная (Pelargonium zonale L.) или роза (Rosa L.).

Реактивы - 96 % спирт или 80 % раствор ацетона, СаСО3.

Оборудование то же, что в исследовании 17, кроме настольной электролампы, но необходим ФЭК или спектрофотометр (СФ-10).

Схема исследования

1. Получение вытяжки пигментов из листьев лука или амариллиса.

2. Получение вытяжки пигментов из листьев пеларгонии или розы. Фотоколориметрическое определение содержания пигментов

Методика исследований

А. Для массовых определений пигментов листа широко используются фотоэлектроколориметры. Однако одним из наиболее точных приборов для количественных определений пигментов является спектрофотометр, который позволяет без калибровочных кривых, на основании экспериментально полученных данных по оптической плотности и известных для каждого пигмента величин молярного или удельного коэффициента погашения при определенной длине волны рассчитать концентрацию пигментов. Принцип фотоэлектрической колориметрии заключается в том, что световой поток, прошедший через кювету с раствором или растворителем, попадает на фотоэлемент, который превращает световую энергию в электрическую.

Так как сила фотоэлектрического тока прямо пропорциональна интенсивности света, то любом окрашенный раствор, помещенный между источником света и фотоэлементом, будет влиять на силу тока. Чем концентрированнее раствор, тем больше лучей он поглощает, тем слабее будет возникающий в фотоэлементе ток. Сравнивая два раствора, можно измерить с помощью гальванометра разницу силы тока, вызванную различной освещенностью, и по ней определить концентрацию исследуемого вещества.

Эти определения проводят с помощью фотоэлектроколориметров. Наиболее удобны те из них, в которых ток фотоэлемента, вызванный лучами света, прошедшими через кювету с исследуемым раствором, компенсируется тем или иным способом. Обычно для компенсации пользуются вторым фотоэлементом, освещаемым тем же источником света. При этом методе гальванометр используется не для измерения силы тока, а только как нулевой прибор, и главную роль играет его чувствительность.

При фотоколориметрировании для каждого пигмента предварительно составляется калибровочная кривая. Для этого в качестве исходного стандарта берут раствор пигмента известной концентрации или используют искусственно приготовленный стандарт.

В качестве исходного раствора можно пользоваться ацетоновой вытяжкой, полученной из свежих листьев примулы (Primula obconica), концентрация которой, как указывалось выше, устанавливается на спектрофотометре или на другом приборе.

Исходный раствор должен иметь концентрацию хлорофилла 40- 60 л/г/л (для непосредственного определения на СФ-26 такой раствор слишком концентрирован, поэтому его надо разбавить и учесть разведение при расчете концентрации).

При построении калибровочного графика для определения хлорофилла из полученного исходного раствора путем соответствующих разбавлений готовят серию (4-5) стандартных растворов с концентрацией пигмента в пределах от 1 до 15 мг/л. Растворы готовят в мерных колбочках на 25 мл (дву-, трехкратная повторность).

При определении оптической плотности испытуемых растворов (надо так подобрать толщину слоя, чтобы величина оптической плотности находилась в пределах средней части калибровочной кривой - от 0,1 до 0,5. Определив оптическую плотность раствора, находят по калибровочной кривой концентрацию пигментов в нем.

При отсутствии раствора естественного пигмента пользуются искусственно приготовленными стандартами.

Для определения зеленых пигментов в качестве стандарта пользуются раствором Гётри, окраска которого соответствует окраске I раствора, содержащего 85 мг/л омыленного хлорофилла (рис. 30).

Рис. 30. Спектр поглощения раствора хлорофилла и раствора Гётри:

1- хлорофилл; 2 - раствор Гётри

Раствор Гётри приготавливают следующим образом. В мерную колбу объемом 100 лм наливают 28,5 мл 1 %-ного раствора CuSO₄ ∙5Н₂0, 50 мл 2 % раствора К₂Сr₂О₇ и 10 мл 2 н раствора NH₄ОН или 7 %-ного аммиака, доливают дистиллированной воды до метки и тщательно перемешивают.

Определение желтых пигментов

Колориметрическое определение. В качестве стандарта следует применять растворы каротиноидов. Хорошие результаты получаются также при использовании в качестве стандарта раствора азобензола. Раствор, содержащий 14,5 мг азобензола в 100 мл 96 % спирта, соответствует по окраске раствору каротина, содержащему 2,35 мкг/мл, а ксантофилла - 2,52 мкг/мл.

Профессор И.И. Гунар (1972) при количественном определении каротиноидов рекомендует использовать в качестве стандартного раствора (К₂Сr₂O₇) - хромовокислый калий.

На аналитических весах отвешивают 290 мг К₂Сr₂O₇, переносят в мерную колбу на 1 л, растворяют в дистиллированной воде, доливают воды до метки и тщательно встряхивают. 1 мл приготовленного раствора по окраске соответствует 2,35 мкг каротина и 2,52 мкг ксантофилла.

Из исходного раствора последовательным разбавлением готовят в мерных колбочках на 100 мл серию стандартных растворов, определяют их оптическую плотности на ФЭК-56М (с синим фильтром) и на основании полученных данных строят калибровочный график. Его используют для нахождения концентрации каротиноидов.

Суммарное определение хлорофилла (а, в) на ФЭКе-56М

Техника получения вытяжки пигментов из листа описана в исследовании 17, работа на ФЭК в исследовании 3.

Процент пигмента на сырую навеску вычисляют по формуле:

1) хлорофилла: % хл = мг хл/л х 100 (1)

К х m

2) каротиноидов: % каротин = мг/ мл х1000 х100 (2)

К х m

где мг хл/л - мг хлорофилла в литре определяется по калибровочному графику;

мг/мл - каротиноидов в миллилитре определяется по калибровочному графику;

К - коэффициент отношения литра к объему вытяжки;

m- масса навески, мг.

Результаты исследования заносят в табл. 26.

26. Содержание пигментов: хлорофилла (а + в), каротина и ксантофилла в листьях растений разных экологических групп, %

Объект исследований

Навеска листьев, мг

Объем вытяжки, мл

Показания шкалы барабана

Количество пигмента по калибровочной кривой, мг на мл, л

Содержание пигмента, % от массы

Б. Отдельное определение количества пигментов в листьях с использованием хроматографии. Определение концентрации хлорофиллов а и b, а также каротиноидов без их разделения затруднено, так как спектры их сильно перекрываются, поэтому с целью установления их концентрации в органах растения приходится разделять. Наиболее приемлем метод Сапожникова и др. (1959).

Разделение пигментов на одномерной хроматограмме

Для разделения зеленых пигментов берут лист хроматографической бумаги размером 16 x16 см и на одной из его сторон проводят простым карандашом с помощью линейки тонкую линию, отступив снизу и от краев на 2,5 см. Бумагу зажимают между чистыми стеклянными пластинами так, чтобы линия находилась над промежутком (рис. 31). Вдоль линии наносят калиброванной пипеткой с оттянутым носиком 1-2 мл ацетоно-спиртовой вытяжки пигментов в виде узкой полосы. Так как для анализа используют сравнительно большой объем раствора, то наносить его надо в несколько приемов. Каждую последующую порцию наносят только после подсушивания предыдущей дозы в токе воздуха от вентилятора.

После нанесения указанного количества вытяжки бумагу свертывают в полый цилиндр и соединяют его верхние уголки скрепкой. Однако края не должны касаться друг друга. Цилиндр помещают в стеклянный сосуд высотой 20 см и диаметром 10-14 см, на дно которого предварительно ставят чашку Петри с 20 мл смеси петролейного эфира и этилового спирта в объемном отношении 20:1 (или 20:1,5), и тотчас же герметично закрывают стеклом. Уровень смеси растворителей должен быть ниже стартовой полосы примерно на 1 см.

На время хроматографирования сосуд накрывают чехлом из черной материи или бумаги.

Разделяют зеленые пигменты восходящим током смеси растворителей. Операцию заканчивают через 20-30 минут. Как только хлорофилл а полностью отделится от хлорофилла b, бумагу вынимают из сосуда, подсушивают и ножницами вырезают полоски с соответствующими пигментами (верхняя сине-зеленая полоса - хлорофилл а, нижняя желто-зеленая - хлорофилл b). Каждую полоску разрезают на мелкие кусочки и помещают их в бюкс для элюирования пигмента. Для этого кусочки заливают 2-3 мл смеси ацетона и спирта (в отношении 3:1), встряхивают содержимое бюкса, а потом раствор переносят в мерную колбочку (или мензурку) на 10 мл. Операцию повторяют до тех пор, пока не обесцветится бумага. Затем объем элюата доводят смесью растворителей до 10 мл и определяют в нем концентрацию пигмента на фотоэлектроколориметре.

Содержание хлорофиллов а и b рассчитывают по формуле:

где X - количество пигмента, мг на 1 г веса сырых листьев;

С - концентрация пигмента, найденная по калибровочному графику, мг в 1 мл раствора;

V - общий объем вытяжки, мл;

v-объем элюата, мл;

m-навеска листьев, взятая для анализа, г;

n-объем вытяжки, нанесенной на хроматографическую бумагу, мл.

Рис. 31. Нанесение вытяжки на хроматограмму: 1- хроматографическая бумага; 2 -стеклянные пластинки; 3 - пипетка

Определение каротиноидов

1-2 мл ацетоно-спиртовой вытяжки калиброванной пипеткой наносят на лист хроматографической бумаги размером 16 x 16 см указанным выше способом. Последовательность и характер дальнейших операций те же, что и в предыдущей работе. Различие состоит лишь в том, что для хроматографической разгонки каротиноидов в чашку Петри берут 20 мл смеси бензола и петролейного эфира в отношении 2:1.

Восходящий ток смеси растворителей извлекает из стартовой полосы каротиноиды и разделяет их на отдельные зоны в следующем порядке: вверху - каротин, ниже - лютеин и еще ниже - виолаксантин. Хлорофилл а и b разделяются слабо. Полное разделение названных каротиноидов происходит за 20-30 минут. После этого бумагу вынимают из сосуда, подсушивают и вырезают полосы с каротином и ксантофиллами. Потом разрезают их на мелкие кусочки и помещают в бюксы. Элюируют пигменты смесью ацетона и спирта (3:1). Экстракты доводят в мензурке смесью растворителей до 5-10 мл (в зависимости от окраски раствора), а затем колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром.

Содержание отдельных каротиноидов в растительном материале рассчитывают по той же формуле, что и содержание хлорофиллов а

Результаты исследований заносят в табл. 26, на основе ее данных делают выводы.

Определение концентрации хлорофилла и каротиноидов на спектрофотометре

Методика определения: Включают прибор согласно инструкции и прогревают его на 30-45 мин. После прогрева прибора часть полученного экстракта наливают кювету спектрофотометра. Вторую кювету, заполненную чистым растворителем (80 %-ный раствор ацетона), используют как контрольную. Кюветы помещают в кюветную камеру спектрофотометра определяют оптическую плотность D вытяжки при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов а и b в растворе ацетона, 663 и 646 нм. Для определения каротиноидов вытяжку промеряют при А=470 нм. Концентрацию хлорофиллов а, b и каротиноидов рассчитывают по формулам:

где С_а, C_b, и С_кар - концентрация хлорофиллов а, b и каротиноидов, мг/л.

D - оптическая плотность при длине волны в формуле.

Затем вычисляют содержание пигментов А в растительном материале, мг/г сырой массы:

A=VC/ 1000P, где

С - концентрация пигментов, мг/л;

V - объем вытяжки, мл (25 мл);

Р - навеска растительного материала, г (0,1- 0,2 г) и процент пигмента (% пг) на сырую массу по формуле: % пг = А/10, где А - содержание пигмента в 1 грамме.

Содержание хлорофилла в листьях растений составляет в среднем около 0,3 % сырой массы (0,1...0,7 %). При расчете на 1 дм² листовой поверхности количество хлорофилла варьирует в пределах 0,7...0,8 мг. Каротиноидов в листьях примерно в три- восемь раз меньше, чем хлорофилла.

Результаты исследований заносят в табл. 27.

27. Содержание пигментов в листьях растений различных экологических групп

Вариант	Навеска листьев, мг	Объем вытяжки, мл	Оптическая плотность			Содержание пигментов, % массы сырых листьев
			D663	D646	D470,5	Хлорофилл а	Хлорофилл b	Хлорофилл а+ хлорофилл b	каротиноиды

На основе полученных данных делают выводы.

Методы исследования фотосинтеза

Теоретические основы исследования

Фотосинтез и дыхание растений определяют по тем изменениям, которые вызываются этими процессами в самом растительном организме или в окружающей его среде Ряд методов основан на определении изменения сухого веса, содержания органического вещества или углерода в растительном объекте.

Наиболее распространенными являются газометрические методы определения фотосинтеза, учитывающие изменения в содержании углекислоты и кислорода в окружающей растение среде. Фотосинтез наземных растений определяется главным образом по поглощению углекислоты, а водных по выделению кислорода. Применение манометрического метода Варбурга позволяет определять фотосинтез наземных растений и по выделению кислорода.

Среди газометрических методов различают две группы:

1) растение помещают в замкнутую систему (эвдиометр, герметически закрытая колба или склянка);

2) листья растений или же растение целиком помещают в камеры, через которые просасывается ток воздуха.

Главный недостаток методов первой группы - изменение состава газов за время опытной экспозиции. Поэтому при изучении фотосинтеза в закрытых приемниках небольшой емкости (эвдиометр) приходится обогащать воздух в них углекислотой.

Методы второй группы дают возможность работать с растением в естественных условиях, при нормальном содержании углекислоты в воздухе, и с листьями, не отделенными от растений. Эти методы часто используются для характеристики фотосинтеза растений в природных условиях. Большим достоинством этих методов является возможность определения динамики изучаемого процесса на одном объекте, не вынимая его из камеры, то есть фотосинтез растений определяют по тем изменениям, которые он вызывает в самом растительном организме или в окружающей его среде.

Ряд методов основан на определении изменения сухого веса, содержания органического вещества или углерода в растительном объекте.

Необходимо отметить, что в настоящее время применяют ряд новых перспективных методов исследования фотосинтеза. Так, например, изотопный метод с радиоуглеродом С¹⁴. Этот метод позволяет выявить многие стороны внутреннего процесса, в частности вопрос об акцепторах углекислоты в процессе фотосинтеза, образования промежуточных и конечных продуктов, передвижения их и т. д. Успешно применяется радиоуглеродный метод и для определения интенсивности фотосинтеза в разных условиях произрастания растений, при воздействии на них ряда внутренних и внешних факторов. В отличие от обычных газометрических методов большое преимущество изотопного метода состоит в том, что он позволяет определить то количество углерода, которое усвоено ассимилирующим объектом в процессе фотосинтеза и превращено в органические соединения клеток.

Методика постановки опытов с радиоактивным углеродом и применение его для характеристики ряда сторон фотосинтеза и дыхания изложены в работах О.В. Заленского, О.А. Семихатовой, В.Л. Вознесенского и других исследователей.

Исследование 21. Влияние интенсивности освещения на поглощение растением из замкнутой системы углекислого газа (СО₂)

Цель исследования:

2. Изучить влияние интенсивности света

а) на поглощение из воздуха СО₂;

б) на образование органического вещества.

Объекты исследования, реактивы, оборудование

Объекты исследования - листья пеларгонии или фиалки африканской (Saintpaulia jonantha Wendl.), элодея.

Реактивы - 0,02 н. раствор Ва(ОН)₂ в бутыли, соединенные с бюреткой, закрытой пробкой, в которую вставлена трубка с натронной известью (рис.32, справа), 0,02 н. НС1 или Н₂С₂О₄ (щавелевой кислоты с бюреткой), фенолфталеин в капельнице.

Оборудование - большие колбы - на 800-1500 мл с коротким и широким горлом (4 шт.), две пипетки на 20-25 мл, линейка, ножницы, восковой карандаш, весы с разновесами на 1 кг.

Схема исследования

1. Влияние обычного освещения (20-25 тыс. люкс) на поглощение СО₂ растением.

2. Влияние интенсивного освещения (40-50 тыс. люкс) на поглощение СО₂ растением.

Методика исследования

Исследование влияния освещенности на интенсивность поглощения углекислоты растениями проводится на основе метода Л.А. Иванова и Н.Л. Коссович.

Определение интенсивности фотосинтеза проводится по количеству углекислоты, которая поглощается растением в замкнутой атмосфере с постоянным объемом воздуха. Для этого испытуемые растения помещают в большую стеклянную колбу и выдерживают некоторое время на свету. По окончании опыта в колбу вводят определенное количество барита для поглощения оставшейся в ней углекислоты Ва(ОН)₂+СО₂=ВаСО₃+Н₂О. Зная количество углекислоты в колбе до опыта и после него, по разности между этими величинами вычисляют количество СО₂, которое растение поглотило в опытных условиях.

Метод достаточно прост и удобен для работы не только в лабораторных, но и в полевых условиях. Большие размеры колб позволяют проводить определение фотосинтеза растений в воздухе, не обогащая его углекислотой, как это делают при работе с эвдиометрами. Удобно также и то, что проведение опыта и определение углекислоты по окончании его проводят в одной и той же колбе.

В опытах применяются колбы (круглодонные, плоскодонные или конические) емкостью 0,5-2 л и больше (рис. 32). Плоскодонные и круглодонные колбы должны иметь короткое и широкое горло (длина 6-8 см, диаметр 3-4 см). Такие колбы удобны для проведения опытов и с побегами или листьями, не отрезанными от растений. Колбы надо выбирать одинаковые по качеству стекла, толщине стенок. Желательно, чтобы в каждом опыте колбы были одинакового объема.

К каждой колбе должны быть подобраны две плотно входящие в нее резиновые пробки. Запасная пробка, вставляемая в колбу по окончании опыта, имеет отверстие для титрования. Оно должно герметически закрываться стеклянной палочкой и открываться только во время титрования.

Рис. 32. Приборы Л.Я. Иванова для ассимиляции (колбы)

Перед опытом все колбы в течение часа выдерживают с открытыми горлами. Практически хорошие результаты получаются и при выдерживании открытых колб в одинаковых условиях в течение 1 часа. При заполнении колб воздухом в лабораторных условиях нужно это делать вдали от горелок, скопления людей и т. д.

После заполнения колб воздухом закрывают их запасными пробками; две колбы - контрольные, служат для определения исходного содержания углекислоты в воздухе, остальные - опытные (с растениями).

При работе с листьями или побегами, не отделенными от растений, на стебель или черешок надевают резиновую пробку, имеющую разрез по радиусу до центрального отверстия в ней. Затем быстрым движением вынимают из колбы запасную пробку и вместо нее вставляют пробку с растением. Все щели в пробке промазывают смазкой, приготовленной из воска с вазелином. При работе с листьями или побегами, отделенными от растений, те и другие прикрепляют к стеклянной палочке и вводят вместе с ней внутрь колбы. Конец черешка погружают в маленькую пробирочку с водой, которую прикрепляют к той же стеклянной палочке. При короткой экспозиции (5-10 мин) можно укрепить черешок листа на проволоке в пробке без снабжения его водой. Введение растения в колбу требует большой осторожности: в колбу не должна попадать углекислота, выделяемая экспериментатором при дыхании.

Определяют площадь листа или вес его без черешка (в зависимости от задачи эксперимента). Затем приступают к анализу воздуха в колбах. Для этого вынимают из пробки стеклянную палочку и в каждую колбу наливают точно отмеренное количество (20-25 мл) 0,02 н. раствора Ва(ОН)₂ и 2-3 капли фенолфталеина.

Объем приливаемого барита зависит от содержания углекислоты, объема колб и т.п. Барит вводится из бюретки с сильно оттянутым концом, чтобы избежать разбрызгивания раствора. После этого отверстие в пробке закрывают стеклянной палочкой. Полное поглощение углекислоты в колбах достигается примерно через 30-40 мин при периодическом встряхивании колб. По истечении этого времени избыток барита, не связавшегося с СО₂, в этой же колбе, оттитровывают раствором 0,02 н. соляной или щавелевой кислоты, вторая также приливается через отверстие в пробке. Один миллиграмм раствора барита и кислоты (соляная или щавелевая) такой же концентрации соответствует 0,44 мг СО₂. Для полного поглощения углекислоты надо налить в колбу избыток барита, так чтобы с углекислотой прореагировало не больше 25-30% его.

Количество углекислоты, найденное в опытной колбе показывает, сколько углекислоты осталось в ней после пребывания растений, исходное содержание углекислоты в объеме данной колбы без растений дает контрольные колбы. Анализ углекислоты в этих колбах позволяет определить содержание ее в литре воздуха, затем путем соответствующих пересчетов и в опытных колбах. По разности между содержанием углекислоты в колбах до и после опыта определяют количество углекислоты, поглощенное растением.

Интенсивность фотосинтеза рассчитывают в миллиграммах СО₂ на единицу листовой поверхности (дм2, м2) или на грамм веса в час. По формуле:

Ин.Ф = (А-В)х 0,44 х60 / (S х t), где

А - количество HCI, пошедших на титрование барита в контрольной колбе; В- количество HCI, пошедшей на титрование барита в опытной колбе;

0,44 - число мг СО₂, соответствующее 1 мл 0,02 н. HCI; S - площадь листа, дм.; t - экспозиция, мин; 60 - коэффициент перевода в часы.

При работе вышеописанным методом необходимо иметь в виду сильное изменение содержания СО₂ в колбе за время опытной экспозиции. По мере потребления СО₂ содержание ее в колбах уменьшается. Это может привести к снижению интенсивности фотосинтеза, так как при низких концентрациях СО₂ наблюдается пропорциональность между интенсивностью фотосинтеза и концентрацией СО₂ в воздухе. Для уменьшения погрешности следует полученные величины интенсивности фотосинтеза привести к исходному содержанию СО₂ колбе. Для этого по окончании опыта необходимо рассчитать, какое количество СО₂ в процентах от исходного осталось в колбах, и затем внести соответствующую поправку. Например, в процессе фотосинтеза было поглощено 20% СО₂; следовательно, в конце опыта фотосинтез протекал при концентрации 80% СО2 от исходной. Можно считать, что во время опыта фотосинтез протекал при средней концентрации СО₂, равной 90% от исходной - (100 + 80) / 2. Пусть интенсивность фотосинтеза растения, установленная в опыте, была 4 мг СО₂ дм²час. Если привести эту величину к исходному содержанию СО₂, то интенсивность фотосинтеза будет несколько выше, а именно - 4,4 мг СО₂/дм²час. Результаты исследований заносят в табл. 28.

28. Влияние освещения на интенсивности фотосинтеза, СО₂/дм²час

Вариант опыта	Объем колбы	Прилито барита		На титрование пошло НСl, мл	Мл барита связано с СО2	Мг,СО2 в колбе	Поглощено СО2, мг при фотосинтезе	Интенсивность фотосинтеза
		мл	мл с поправкой к титру
Опыт
Контроль

На основе данных табл. 28 делают выводы и заключение.

Исследование 22. Влияние спектров света на интенсивность выделения кислорода водными растениями при фотосинтезе

Теоретические основы исследования

Из общего суммарного уравнения фотосинтеза (с. 81) видно, что источником водорода для фотосинтеза у высших растений, водорослей и цианобактерий является вода, а кислород воды выделяется в окружающую среду, в частности, у водоросли в воду. Поэтому они являются хорошим доступным объектом исследования интенсивности фотосинтеза методом счета пузырьков кислорода, выделяющегося из межклетников через срез.

Хотя данный метод не отличается большой точностью, но зато очень прост и дает наглядное представление о тесной зависимости процесса фотосинтеза от спектра света.

Цель исследования: определить влияние интенсивности освещенности и спектров света на фотосинтез водного растения.

Объекты исследования, реактивы, оборудование.

Объект исследования - элодея канадская, выдержанная 2-3 дня в условиях хорошего освещения.

Реактивы - сода двууглекислая; 1 %-ный раствор К₂Сг₂О₇; 4 % раствор CuSO₄ х 5H₂O, насыщенный аммиаком.

Оборудование: кювета, пинцет длинный, лезвие бритвы, пробирка, вставленная в колбочку или специальный сосуд со стоком внизу (в последнем случае сосуд закрепляют в чугунном штативе), лампа настольная, песочные часы на 3 -5 мин, электроплитка, термометр, колбы (3 шт.), линейка, спектроскоп в штативе, пробирки (2 шт.), люксметр.

Схема исследования.

1. Пробирка с элодеей за экраном чистой воды на расстоянии 10 см от источника света - контроль (пропускаются лучи видимого света).

2. Пробирка с элодеей за экраном чистой воды на расстоянии 20 см от источника света - контроль (пропускаются лучи видимого света).

3. Пробирка с элодеей за экраном раствора К₂Сг₂О₇ - пропускаются красные, оранжевые и желтые лучи и не пропускаются сине-фиолетовые.

4. Пробирка с элодеей за экраном раствора серно-аммиачномедной соли, пропускающей голубые, синие и фиолетовые лучи, но задерживает длинноволновую часть спектра.

Методика исследований

Поместить веточку элодеи (5-7 см) с неповрежденной верхушечной почкой в сосуд с водой и обновить срез острой бритвой для устранения возможной закупорки путей выхода газа. После этого нагрузить ее срезом вверх в пробирку с водой (рис. 33), предварительно обогащенной диоксидом углерода путем растворения небольшого количества соды (NaHCO₃)- на кончике ножа так, чтобы срезанный конец элодеи был на 3-5 см ниже уровня воды в пробирке.

Далее пробирку 1 с элодеей помещают в сосуд 2 (рис. 33), где расстояние между наружной стенкой пробирки и внутренней стенкой сосуда должно быть около 4-6 мм. Для этой цели используют мерный цилиндр на 100 мл. На верхнюю и нижнюю части пробирки 1 надеть жгуты из тонкого шланга скрепляя их концы дугообразной скобкой.

Пространство между стенками сосуда заполняется водой до уровня на 5-8 мм ниже краев сосуда 2 или жидкостями, исполняющими роль светофильтров, пропуская лучи спектра, который определяют с помощью спектроскопа. Например, используемые в исследовании растворы - 1%-ный К₂Сг₂О₇ пропускает красные, оранжевые и желтые лучи, а раствор серно-аммиачно-медной соли - соответственно голубые, синие и фиолетовые лучи, но задерживает длинноволновую часть спектра.

Объем жидкости для заполнения пространства в сосуде 2 предварительно определяется. Последняя должна иметь температуру 23-25 ° С во всех вариантах исследования, а прибор 2 находится на расстоянии 10 или 20 см. от источника освещения (согласно схеме исследования). При смене жидкости в сосуде 2 пробирка с элодеей вынимается, жидкость сливается, сосуд 2 промывается чистой водой и снова заполняется раствором для продолжения исследований. Вместо жидких экранов можно использовать стеклянные светофильтры, пропускающие лучи определенной длины волны.

Помещая пробирку 1 с элодеей в те или иные условия, необходимо дождаться периода адаптации объекта исследования к создаваемым условиям - равномерного тока пузырьков и только после этого начать их подсчет за определенный период времени (3-5 мин). Результаты исследований заносятся в табл. 29 и делаются выводы.

Рис. 33. Установка для определения интенсивности фотосинтеза методом счета пузырьков

29. Влияние мощности освещения и спектров света на интенсивность фотосинтеза элодеи

Расстояние от источника света, см	Мощность светового потока, люкс	Экран	Спектр освещения	Число пузырьков за 5 мин.
10	500	Вода, К2Сг2О7 CuSO4 х5H2O + NH3	Белый, К, О, Ж, 3, Г, С,Ф