Лабораторная работа
к теме №2
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Целью данного блока
исследований является ознакомление с
важнейшими свойствами живой цитоплазмы - вязкостью, проницаемостью, гетерогенностью составляющих ее веществ. Показать роль
клеточных структур и пограничных слоев цитоплазмы в процессе поступления воды и
различных веществ в клетку. Получить представления о
лабильности свойств цитоплазмы, их взаимосвязи и приспособительном значении.
Исследование 1.
Изучение влияния катионов солей на вязкость цитоплазмы плазмолитическим
методом
Теоретические основы исследования
Одним из важнейших показателей
физико-химического состояния цитоплазмы является ее вязкость, так как она имеет
большое приспособительное значение в жизни растений при изменении внешних
факторов - температуры, водообеспеченности и т, д.
Обезвоживание цитоплазмы естественным путем, например, при созревании семян или
под действием концентрированных кислот и щелочей, увеличивает ее вязкость.
Катионы кальция и алюминия, образуя дополнительные точки сцепления между
отдельными молекулами белков цитоплазмы, повышают ее вязкость. Ионы калия
увеличивают оводненность цитоплазмы, разжижая ее,
снижают вязкость последней.
Вязкость цитоплазмы зависит
также от видовых особенностей растения, характера экотипа, возраста органа и
фазы онтогенеза растения. Она может быть различна в разных органах. В целом
вязкость цитоплазмы тесно связана с жизнедеятельностью растений, поэтому она
весьма лабильный показатель.
Имеется несколько методов определения
вязкости цитоплазмы. Один из наиболее простых, наглядных способов - это
определение ее вязкости по времени плазмолиза. Время плазмолиза - это
промежуток
времени от погружения клеток в
гипертонический раствор до появления выпуклого плазмолиза более чем у половины
клеток в поле зрения микроскопа. Время плазмолиза находится в прямой
зависимости от вязкости цитоплазмы. Чем ниже вязкость цитоплазмы, тем легче она
отстает от клеточной оболочки и переходит в вогнутый выпуклый плазмолиз, т. е.
время плазмолиза меньше.
Цель исследования: установить влияние катионов (К+, Na+ и Са2+) на
вязкость цитоплазмы на фоне сахарозы (контрольный вариант).
Объекты исследований,
реактивы, оборудование
В качестве объектов
исследования можно взять:
л) эпидермис лука (Allium
sepa) или традесканции (Tradescantia discolor), или бегонии королевской (Begonia rex Putz), содержащих
антоцианы, а также одновозрастные
листья элодеи (Elodea canadensis), или мха мниум
(Mnium splendens).
Реактивы: 1М растворы сахарозы, KNO3,NaNO3;
Схема исследования (опыта):
1.Эпидермис лука или другого растения в
растворе сахарозы (контроль);
2. Эпидермис лука или другого растения в
растворе KNO3 (вариант опыта);
3.Эпидермис лука или другого
растения в растворе NaNO3;
4. Эпидермис лука или
другого растения в растворе Ca(NO3)2 Методика исследования
Кусочек ткани исследуемого объекта поместить на предметное стекло в
каплю воды и рассмотреть исходное состояние клеток. После этого исследуемый
объект помещают в каплю растворов сахарозы и солей, согласно схеме исследования (в
каждом варианте опыта берется новый эпидермис объекта исследования).
Отметить
время погружения и через каждые 5 минут (4 раза) рассматривать объект в микроскоп и фиксировать степень (форму) плазмолиза (рис.12). Результаты исследования заносить в
таблицу 1.
Влияние
катионов солей на время плазмолиза
|
Вариант опыта |
Плазмолитики |
Концентрация раствора в м/литр |
Время погружения
ткани в раствор |
Время
наступления плазмолиза в мин. |
Длительность вогнутого плазмолиза |
|
|
Вогнутого |
выпуклого |
|||||
|
1. |
Сахароза
(контроль) |
1,0 |
|
|
|
|
|
2. |
KNO3 |
1,0 |
|
|
|
|
|
3. |
NaNO3 |
1,0 |
|
|
|
|
|
4. |
Ca(NO3)2 |
0,7 |
|
|
|
|
Если переход от вогнутого к выпуклому плазмолизу не происходит в течение длительного времени наблюдения
(например, 20 мин), то отмечают, что время плазмолиза данного объекта больше 20
мин.
Исследование 2. Изучение
прохождения одновалентных и двухвалентных
катионов солей через структурные слои протопласта
Теоретические основы исследования
Протоплазма вакуолизированной растительной
клетки при исследовании ее оптическими методами кажется
однородной. В В
действительности же в ней установлено наличие трех слоев с различными свойствами: наружный -
плазмалемма, внутренний, граничащий с вакуолей, - тонопласт
и залегающая между ними толща плазмы - мезоплазма. В
наличии указанных слоев плазмы можно убедиться, изучая поглощение веществ
растительной клеткой.
Цель исследования: Установить проницаемость структурных слоев протопласта для
одновалентных и двухвалентных катионов на основе колпачкового
плазмолиза.
Объекты исследования,
реактивы, оборудование.
Объекты исследования - эпидермис окрашенных растений (лука, традесканции и др.). Реактивы - растворы:
1М KNO3,0,7M Ca(NO3)2,
Рис 12. Последовательные стадии плазмолиза:
1 – тургесцентная
клетка, 2 – общее сокращение объема клетки; 3 – уголковый плазмолиз,
4 – вогнутый плазмолиз, 5 –выпуклый плазмолиз
эозина. Оборудование: препаровальные иглы, стеклянные палочки, предметные и
покровные cтекла, микроскоп, сосуды на 5-10 мл.
Схема исследования А:
1. Эпидермис растения (лука) в воде
(контроль - исходная форма).
2. Эпидермис растения
(лука) в 1М КNОз
3. Эпидермис растения (лука) в 0,7М Са(NОз)2
Методика исследования
В 5 – 10 мл стеклянные сосудики (бюксы или др.) наливают по 1-3 мл воды или раствор, согласно схеме
исследования. Помещают в них плоскостные срезы эпидермиса выпуклой стороны
чешуи окрашенного лука. Через 1-1,5 часа просматривают срез под микрокопом.
Вследствие того, что взятые растворы сильно гипертоничены,
во всех клетках наблюдается
сильный плазмолиз.
В одном из вариантов исследования со стороны поперечных стенок плазма имеет вид колпачков. Ядро
также сильно увеличено. Увеличение объема
плазмы и ядра - следствие набухания плазмы, которое вызвано прониканием катионов через плазмалемму в мезоплазму.
Между тем через тонопласт эти катионы не проникают, о
чем можно заключить по отсутствию увеличения
объема вакуоли.
Следовательно,
данный опыт доказывает различную проницаемость
наружного и внутреннего пограничных слоев плазмы. Результаты наблюдения
занесите в табл. 2.
Таблица
2
|
Вариант опыта |
Концентрация раствора в м/литр |
Наличие колпачкового
плазмолиза |
Увеличение |
||
|
мезоплазмы |
ядра |
вакуоли |
|||
|
1. вода |
1,0 |
|
|
|
|
|
2. KNO3 |
1,0 |
|
|
|
|
|
3. Сa(NO3)2 |
0,7 |
|
|
|
|
О непроницаемости тонопласта для определенных
катионов можно наблюдать и на основе метода обнаружения тонопласта
по де-Фризу.
Схема исследования Б:
1.
Срез эпидермиса бесцветного лука в капле эозина -
индикатор-
контроль;
2. Срез эпидермиса бесцветного лука в капле 1М KNO3 + каплю эозина.
3. Срез эпидермиса бесцветного лука в капле
Методика исследования.
Эпидермис
вогнутой (морфологически верхней) стороны чешуи бесцветного лука помещают на
предметном стекле в каплю растворов, согласно схеме исследования Б. Через 3-5
мин начинают наблюдения под микроскопом. Хорошо заметно уменьшение объема вакуоли в одном из вариантов.
Вначале плазма окружает вакуолю тонким слоем, но очень быстро начинается
набухание плазмы, а затем отмирание плазмы и ядра, вызванные действием катиона и эозина, которые
проникли в мезоплазму. Участки отмершей плазмы, окрашенные в ярко-розовый
цвет, хорошо заметны.
Так же, как в предыдущем опыте, в течение длительного времени вакуоля остается
сокращенной и неокрашенной в розовый цвет. Следовательно, ни катион, ни эозин не
проникают через тонопласт и вакуолю.
Результаты наблюдений заносятся в табл.
3.
Таблица 3
Проницаемость структур растительной клетки для катионов + эозин и
эозина
|
Вариант исследования |
Окраска |
||
|
мезоплазмы |
ядра |
вакуоли |
|
|
1. Эозин |
|
|
|
|
2. Эозин + KNO3 |
|
|
|
|
3. Эозин + Сa(NO3)2
|
|
|
|
Анализируем полученные данные письменно в
тетради и делаем выводы.
Исследование 3. Влияние температурного и химических
факторов на
жизнеспособность цитоплазмы
Теоретические основы
исследования
Избирательная проницаемость - свойство живой цитоплазмы сохранять постоянство
внутриклеточной среды. При повреждении
клетки цитоплазма теряет это свойство, и
вещества, находящиеся в клеточном соке,
свободно выходят наружу. Степень повреждения коррелируем с количеством выделяющихся в водную среду веществ. Таким
образом, интенсивность выхода веществ из клетки служит критерием ее
повреждения.
Выделившийся из поврежденных клеток пигмент антоциан легко учесть колориметрическим способом.
При повреждении растительной ткани увеличивается сродство цитоплазмы к
красителям. На этом основаны методы определения жизнеспособности семян по окрашиванию
их зародышей и семядолей витальными красителями. Жизнеспособными считаются те
семена,
зародыши и семядоли которых не окрашиваются.
Цель исследования: Изучить влияние температурных и химических факторов на
степень повреждения цитоплазмы.
Объекты исследования,
реактивы, оборудование.
Объект
исследования - корнеплод красной свеклы (Beta vulgaris), реактивы - кипяченая водопроводная вода
комнатной температуры, 30 % раствор уксусной кислоты, 40 % и 96 %-й спирт, 1М раствор KNO3
Оборудование - нитки с иглой, штативы с пятью пробирками, конические
колбы, пробочные сверла, линейки, пипетки с делениями на 10 мл, предметные и покровные
стекла, лезвие бритвы, микроскопы, ФЭК.
Схема исследований
1.Свекла в воде
комнатной температуры - контроль.
2.
Воздействие
температуры 100°С (кипячение) в течение 5 мин.
3.
Воздействие
на свеклу 30% уксусной кислоты
4.
Воздействие
на свеклу 40 % спирта.
5.
Воздействие
на свеклу 96% спирта.
Методика опыта
Из очищенного корнеплода красной свеклы сверлом диаметром 7-
Вариант
опыта с кипячением выполняют следующим образом. В колбу с кипящей водой опускают один из приготовленных кусочков.
Через 2 мин кусочек вынимают и опускают в пробирку с 10 мл воды при комнатной температуре.
Через 30 мин после
начала опыта все пробирки интенсивно и
встряхивают, кусочки свеклы извлекают и сравнивают количество им шедшего
из клеток пигмента в разных вариантах опыта при помощи фотоэлектроколориметра
(ФЭК) на синем светофильтре. При этом в контрольную кювету ФЭК наливают раствор
контрольного варианта. Интенсивность окраски устанавливают по коэффициенту экстинкции на шкале ФЭК. Результаты исследования
заносят в табл. 4.
Таблица
4.
Влияние температурного и химического факторов на
проницаемость цитоплазмы для клеточного сока
|
Показатели
повреждения цитоплазмы |
Варианты исследования |
||||
|
Контроль
(водопроводная вода) |
После
кипячения в воде |
30 %
раствор уксусной кислоты |
40 %
раствор спирта |
|
|
|
Интенсивность
окраски раствора (коэффициент экстинкции по шкале ФЭК) |
|
|
|
|
|
Для
наблюдения за состоянием клеток из кусочка свеклы контрольного варианта и
варианта с наиболее интенсивным выходом веществ
готовят тонкие срезы, помещают их на предметные стекла и каплю 1М раствора КNОз, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. Зарисовывают клетки
срезов контрольного варианта и клетки вариантов с интенсивным выходом веществ.
Результаты опыта записывают в форме табл. 4.
По материалам наблюдений делают выводы о степени повреждения цитоплазмы.
Определение
концентрации растворов на фотоэлектроколориметре
ФЭК-56М
Для установления концентрации окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре измеряют разность силы электрических токов, возникающих между двумя фотоэлементами в
результате неодинаковой интенсивности
световых потоков, прошедших через растворитель и раствор. Общий вид фотоэлектроколориметра ФЭК –
Рис.13. Фотоэлектроколориметр ФЭК – 56
М: 1 – гальванометр; 2, 12 – окна отсчетных барабанов со шкалой; 3
– рукоятка чувствительности; 4 – рукоятка установки стрелки
гальванометра на «О», 5 – барабан переключателя
светофильтров; 6 – корпус прибора; 7 – рукоятка шторки; 8 –
крышка; 9 – кюветодержатели; 10 – барабан
правого кюветодержателя; 11 – барабаны отсчета.
Включают прибор в сеть и тумблер стабилизатора ставят в положение «Включ». Прибору дают прогреться 30 мин. Затем при
закрытой шторке 7 вращением отсчетны барабанов 2 совмещают
риску с «0» делением шкалы, после чего при помощи рукоятки 4
устанавливают стрелку гальванометра 1 на «О». Далее открывают крышку
прибора 8 и в левый кюветодержатель ставят кювету с растворителем (
Показания шкалы барабана переводят в величины
концентрации, используя калибровочный график. Для этого готовят серию
стандартных растворов возрастающей концентрации и находят оптическую плотность
каждого из них. Затем строят график. На оси абцисс
откладывают значения концентрации, а на оси ординат – соответствующие им
значения оптической плотности. Точки пересечения соединяют и получают
калибровочный график.
Стандартные растворы готовят в мерных колбочках на 25 мл; концентрацию
исходного раствора, в частности хлорофилла, обычно определяют на
спектрофотометре. В качестве стандартного показателя можно использовать раствор
Гётри. Кюветы должны быть той же рабочей длины, что и
при определении оптической плотности исследуемого раствора.
Чтобы вычислить концентрацию раствора, на оси ординат находят
установленную величину оптической плотности и от нее проводят горизонтальную
прямую до пересечения с кривой графика. Из точки пересечения опускают
перпендикуляр на абциссу и определяют концентрацию
вещества в мг/мл, л. Ее можно выразить в
процентах от массы, используя формулы 1,
2:
Х= В х V
10 х М
где Х-
процент определяемого вещества;
В
– количество вещества в вытяжке, мг/л
V – объем
вытяжки в мл;
М
– масса навески, взятой для анализа, мг;
10
– коэффициент для выражения в процентах.
При
использовании концентрации мг/мл формула приобретает следующий вид:
Х= В х V х
100/ М,
где В – количество вещества, мг/мл.
Остальные
обозначения, как в формуле.
Результаты
определения записывают в табл. 5.
5. Показатели
определения концентрации раствора на ФЭК
|
Объект
|
Навеска листьев, мг |
Объем вытяжки, мл |
Показания шкалы барабана |
Количество
исследуемого вещества в растворе |
|
|
|
|
|
|
по калибровочному графику, мг /мл, л
|
процент от массы навески
|
|
|
|
|
|
|
|
Исследование 4. Определение
жизнеспособности семян по окрашиванию цитоплазмы
А. Метод Нелюбова для двудольных культур
Б.
Метод Иванова для однодольных культур.
Объекты
исследования, реактивы, оборудование.
Объекты исследования - семена
гороха (Pisium sativum), фасоли (Phasolus vulgaris) и тыквенные (Cucurbitaceae) культуры, пшеница (Triticum aestivum или Т. durum).
Схема исследований.
1. Из семян, замоченных в воде и выдержанных при
комнатной температуре или в термостате согласно методике исследования,
берут 5-10 шт. и помещают в пробирку с 3-5 мл воды. Пробирку с семенами опускают в кипящую водяную баню на 2-3
мин. - контроль.
2. Семена замочены и выдержаны согласно методике
исследования,
Методика
исследования.
Метод Нелюбова
Этим методом устанавливают жизнеспособность семян гороха, фасоли, люпина, конопли и тыквенных.
Берут
10... 15 семян гороха, предварительно намачивают в течение 18 ч при 20 °С,
освобождают от семенной оболочки, помещают в
0,2 %-й раствор индиго-кармина на 2...3 ч при 30 °С.
Затем краску сливают, промывают семена водой и устанавливают их жизнеспособность.
Семена
с неокрашенными корешками и слабо окрашенными семядолями относят к жизнеспособным
объектам. Семена с полностью
окрашенными корешками и семядолями признают нежизнеспособными.
Метод Иванова. Для определения берут десять зерновок пшеницы, предварительно намачивают в воде в течение
10 ч при комнатной температуре, разрезают бритвой вдоль бороздки пополам
и помещают на 15 мин в 0,2 %-й раствор кислого
фуксина или 0,1%-й раствор индигокармина, налитый в стаканчик или бюкс. Краску сливают, промывают семена водой, размещают
пинцетом в чашке Петри или на фильтровальной бумаге и определяют жизнеспособность. У жизнеспособных семян зародыши не
окрашены, у мертвых или сильно
поврежденных окрашены более или менее интенсивно.
Зарисовывают жизнеспособные и
нежизнеспособные семена.
Результаты
исследований занести табл. 6 и сделать практические выводы о годности семян для
посева, если известно, что жизнеспособность семян должна быть не ниже, чем для
тыквенных - 95-98 %, бобовых и зерновых - 90-95 %.
Формула для вычисления жизнеспособности
семян, %:
ЖСС = а-100/в,
где % ЖСС - процент
жизнеспособности семян,
а - число семян, у
которых зародыш (у злаков), корешок и семядоли (двудольные) не окрашены;
в - общее число семян,
взятых для анализа на жизнедеятельность.
6. Характеристика жизнеспособности семян
|
Культура |
Число |
% жизнеспособности семян |
|
|
Семян,
взятых на анализ |
Семян, у которых окрашены
зародыш или корешок и семядоли |
||
|
1.Пшеница |
|
|
|
|
2. Огурцы |
|
|
|
Цифры произвольные
Исследование 5. Определение
водного потенциала растительной ткани методом полосок по Лилиенштерн
Теоретические основы
исследования
Из курса
ботаники известно, что растительная клетка (РК) представляет собой
протопласт, окруженный клеточной стенкой. Клеточная стенка наряду с
опорной и защитной функцией участвует в динамическом процессе водообмена, так как в ее состав вводит целлюлоза,
обладающая гидрофильными свойствами за счет образования водородных связей с
водой. Но важную роль в оводненности взрослой РК играет вакуоль - резервуар, ограниченный тонопластом, в котором находится вакулярный
сок, состоящий из растворенных в воде сахаров,
солей, органических кислот и др. Вещества вакуолярного сока представлены
истинными и коллоидными растворами,
создающими осмотический потенциал клеточного сока.
Осмотическое потенциальное давление прямо пропорционально числу частиц
в единице объема (ионов и молекул) независимо от их размеров и свойств.
Избирательная проницаемость поверхностных мембран цитоплазмы и
эластичность клеточной стенки позволяют рассматривать РК как осмотическую
систему. Вода поступает в РК извне вследствие того, что химический потенциал (активность)
воды окружающего клетку раствора выше, чем
водный потенциал в клеточном соке.
Силу, с которой клетка способна поглощать воду, называют сосущей силой
клетки (5), она равна потенциальному осмотическому давлению клеточного сока
минус давление (упругость), создающееся клеточными стенками, которые
препятствуют поступлению воды в РК. В целом эти силы создают тургорное давление клетки.
Следовательно, математически сосущая сила клетки выражается так: S - П-Р, где S - сосущая
сила клетки; П - осмотическое клеточное
давление; Р - тургорное противодавление
клеточной стенки.
В настоящее время для характеристики энергетического уровня молекул воды (их способности
диффундировать или испаряться) используется термодинамический показатель -
водный потенциал, который для чистой воды
принят за нуль (Ψводы = 0), а для
любого раствора - меньше нуля. При
замене осмотических показателей растительной клетки термодинамическими
вышеприведенное уравнение примет следующий
вид:
- Ψ кл = - Ψп +Ψр
где Ψ кл - водный потенциал
клетки;
Ψп - осмотический потенциал клеточного сока;
Ψр- потенциал тургорного давления.
Из уравнения видно, что осмотический потенциал понижает водный потенциал
клетки, а потенциал давления повышает его. Как правило, Ψ кл отрицателен, и лишь
при полном насыщении клетки водой, когда Ψр = Ψп, этот показатель равен
нулю.
Сосущая сила есть отражение водного потенциала растительной клетки, поэтому его
определяют для того, чтобы вовремя уловить признаки обезвоживания растений и
правильно выбрать время полива.
Метод полосок основан на
подборе наружного раствора такой концентрации, при погружении в который длина
полоски растительной ткани не меняется. Если
осмотический потенциал наружного раствора превышает водный потенциал
ткани, то раствор отнимает воду от клеток, в
результате их объем и длина уменьшаются. Если осмотический потенциал
раствора меньше водного потенциала ткани, то клетки, всасывая воду из раствора,
увеличиваются в объеме, а, следовательно, длина полоски возрастает. В растворе, где осмотический потенциал равен водному
потенциалу ткани, длина полоски не
изменяется.
Цель исследования: Определение водного потенциала
растительной ткани в зависимости от содержания в ней запасных веществ.
Объекты исследования,
реактивы, оборудование
Объекты исследования - клубни картофеля (Solatium tuberosum), корнеплоды свеклы (Beta vulgaris), реактивы: 1М раствор сахарозы; оборудование -
штативы с 12 пробирками, градуированные пипетки на 10 мл, пинцеты, ланцеты,
ножи, часы, миллиметровые линейки, стандартная стеклянная пластинка длиной
в
Схема исследования
1. Полоски из клубня картофеля, опущенные в
растворы сахарозы согласно методике
исследования.
2. Полоски из корнеплода
сахарной или красной свеклы, опущенные в растворы сахарозы согласно методике
исследования.
Методика исследования
В 12 пронумерованных пробирках - в двукратной повторности (6 х 2) готовят по 10 мл
Через 20 мин полоски вынимают, обсушивают фильтровальной бумагой и измеряют их
длину.
Для расчета величины
водного потенциала берут концентрацию, при которой длина полосок не изменилась.
Величину водного потенциала рассчитывают по формуле:
Ψ Ψ= -П = -R х
Т х С х
I х 101,3,
где и - газовая
постоянная (0,00831 кДж/град ∙ моль),
Т - абсолютная
температура по Кельвину (273 + комнатная);
С - изотоническая концентрация
в молях;
I - изотонический коэффициент Вант-Гоффа;
101,3 - множитель
для перевода атмосфер в килопаскали;
Ψ Ψ - водный потенциал в килопаскалях
(кПа).
Для неэлектролитов изотонический коэффициент равен единице, а
для растворов электролитов зависит от числа ионов, на которые распадается
молекула и степени диссоциации. В таблице 7 приведено значение I для растворов солей, которые наиболее часто используются в виде плазмолитиков.
7. Изотонический коэффициент солей Вант-Гоффа
|
Соли |
Концентрация, моль/л |
|||||||||
|
1,0 |
0,9 |
0,8 |
0,7 |
0,6 |
0,5 |
0,4 |
0,3 |
0,2 |
0,1 |
|
|
NaCl
|
1,69 |
1,70 |
1,71 |
1,73 |
1,74 |
1,75 |
1,77 |
1,79 |
1,81
|
1,85 |
|
КС1 |
1,76 |
1,77 |
1,77 |
1,78 |
1,78 |
1,79 |
1,81 |
1,82 |
1,84 |
1,87 |
|
KNO3
|
1,64 |
1,65 |
1,67 |
1,68 |
1,70 |
1,71 |
1,74 |
1,76 |
1,79 |
1,83 |
|
CaCl2 |
1,59, |
1,60 |
1,61 |
1,63 |
1,64 |
1,65 |
1,68 |
1,71 |
1,74 |
1,77 |
|
Ca(NO3)2 |
1,50 |
1,52 |
1,54 |
1,55 |
1,57 |
1,59 |
1,63 |
1,67 |
1,70 |
1,74 |
Результаты
исследования заносят в табл. 8 и дают объяснения о более высоком водном
потенциале у,... ?
8. Показатели водного потенциала
клубня картофеля и корнеплода свеклы
|
Вариант опыта |
Концентрация раствора
сахарозы, моль/л |
На 10 мл раствора |
Длина полоски ткани, мм |
Концентрация
раствора, при которой длина полосок не изменилась, моль/л
|
Водный потенциал,
кПа |
||
|
|
Н2О, мл |
Перед погружением в раствор |
После пребывания в растворе |
||||
|
Картофель |
0,6 |
6 |
4 |
- |
|
|
|
|
0,5 |
5 |
5 |
5 |
|
|
|
|
|
0,4 |
4 |
6 |
- |
|
|
|
|
|
0,3 |
3 |
7 |
- |
|
|
|
|
|
0,2 |
2 |
8 |
- |
|
|
|
|
|
0,1 |
1 |
9 |
- |
|
|
|
|
|
Свекла |
|
|
|
5 |
|
|
|
Исследование
7. Основные запасные вещества растительной клетки
Теоретические основы
исследования
Углеводы, белки, жиры и жироподобные вещества выполняют в клетке
основные функции: строительную, метаболическую, запасающую. Их легче всего
обнаружить в форме запасных веществ. Наиболее удобны для этих целей семена, клубни, корнеплоды, где эти вещества сконцентрированы в значительных
количествах.
Углеводы
растительной клетки находятся в трех формах - мономерной (глюкоза, фруктоза и другие моносахара),
дисахаридной (сахароза, мальтоза и
др.) и полисахаридной (крахмал, инулин, целлюлоза и др.). Благодаря присутствию альдегидной или кетонной группы моносахара
обладают редуцирующими (восстанавливающими)
свойствами. Дисахара - нередуцирующие
вещества, так как их молекула состоит из двух моносахаров,
связанных альдегидной или кетонной группой. Полисахариды также нередуцирующие
вещества, поскольку остатки моносахаров в их молекулах сполимери-зованы за счет альдегидных или кетонных
групп.
Для обнаружения моносахаров используется
реактив Фелинга. Его получают при последовательном сливании
равных количеств растворов медного купороса, щелочи и сегнетовой соли. При взаимодействии медного
купороса со щелочью образуется гидроксид меди в виде
голубых хлопьев. Чтобы предотвратить выпадение его в осадок, вводится сегнетова соль. Реакции
идут согласно уравнениям:
CuSO4+2KOH =
K2SO4+Cu(OH)2↓
СООК СООК
Си(ОН)2
+ │ │
СООН =
СООН \
│ │ Cи ++ + 2Н2О
СООН СООН /
│ │
СООNa| СООNa|
При
кипячении реактива Фелинга с раствором, содержащим моносахара, медь из окисной формы восстанавливается в
закисную форму и выпадает в осадок кирпично-красного цвета.
R –C=O
+ 2 Cu ++ О = R-C=O
+ Cu2 О ↓
│
│
Н
ОН
Обнаружить в исследуемом материале непосредственно дисахара с помощью реактива Фелинга
невозможно. Их необходимо предварительно гидролизовать
до моносахаров. Если в результате гидролиза получится больше осадка закиси меди, чем до
него, значит, в растительной ткани
имеются и дисахара. Таким образом, наличие дисахаров можно оценить и количественно (приблизительно) по
разнице в содержании закиси меди до и после
гидролиза растительной вытяжки.
Для выявления крахмала и
оценки его количества используется раствор
йода, в присутствии которого крахмал синеет. Белки составляют основную
часть протоплазмы растительных клеток.
Однако значительное количество их относится к конституционным и ферментным
белкам, образующим с другими соединениями сложные белки - протеиды (липо, - нуклео
-, металлопротеиды и т. д.). Для обнаружения конституционных
и ферментных белков клетки и ее органоидов существуют специальные методики.
Запасные
белки можно довольно легко экстрагировать из растительной ткани определенными
растворителями. Так, альбумины растворимы в воде, глобулины - в нейтральных
солях (10% сульфат аммония
или хлорид натрия), проламины - в 70% спирте, глютелины - в слабых щелочах.
Для обнаружения белков, используется биуретовая
реакция, с помощью которой выявляются пептидные связи (-CO-NH-),
присущие
всем белкам.
Биуретовая реакция получила
свое название от производного мочевины - биурета.
Молекула биурета с группировкой - CO-NH-образуется из двух
молекул мочевины с отщеплением аммиака и дает то же окрашивание, что и белок.
Две молекулы мочевины → биурет
Биуретовая реакция основана на том, что в щелочной среде (в
присутствии гидроксида натрия или калия) при
добавлении солей меди (медного купороса) аминокислоты
белка образуют окрашенные комплексные соединения с ионом меди (на примере с биуретом) по схеме:
Эта реакция осуществляется
при наличии не менее двух пептидных связей,
за исключением гистидина, серина, треонина
и аспарагина (амид аспарагиновой кислоты), с которыми биуретовая
реакция получается при условии больших концентраций их в растворе.
Белки дают фиолетовую окраску, низкомолекулярные белки и пептиды - розовую.
Серосодержащие белки, в частности, аминокислоты цистеин и цистин
определяют с помощью уксуснокислого свинца в щелочной среде.
Жиры и жироподобные вещества имеются в любой растительной клетке.
Жироподобные вещества в связанной форме (фосфо - и гликолипиды, липопротеиды) выполняют очень
важную структурную функцию, являясь, в
частности, составной частью мембран клетки.
Запасные жиры находятся в цитоплазме в основном в свободной форме, в
виде капель. Жиры - самые высококалорийные вещества,
поэтому они откладываются в семенах более чем у 80% растений. Их много также в
плодах, корневищах, почках, коре деревьев
и т.д.
Жиры хорошо растворимы в органических растворителях (бензин, серный и петролейный эфир), с помощью которых их можно извлечь из
ткани. Эфир наряду с жирами извлекает другие жироподобные вещества (воск, смола и т. д.).
Имеется несколько методов обнаружения жиров, однако некоторые из них малоспецифичны (например, реакция с суданом
III), другие же не
очень наглядны (реакция омыления). Поэтому
для выявления жиров в материале, содержащем
их значительное количество, можно применить прямую экстракцию указанными выше растворителями (лучше бензином).
Цель исследования: Определение в запасающих органах
растений наличия углеводов, белков и жиров.
Объекты исследования, реактивы, оборудование
Объекты
исследования - семена злаков и бобовых: пшеница (Triticum aestivum), ячмень (Hordeum vulgare), горох (Pisum sativum), фасоль (Phasilus), клубни картофеля (Solanum tuberosum), корнеплоды
сахарной или красной свеклы (Beta vulgaris), моркови (Dacus carota).
Реактивы
-
глюкоза, сахароза и сода в порошке (в бюксах); реактив Фелинга, 10 % (NH4)2SO4 или NaCI, 10 % NaOH или 10 % КОН в колбах; 20 % НС1, раствор йода в йодистом калии, 1% раствор CuSO4, 5% уксуснокислый свинец в
капельницах; бензин в пробирке
Оборудование - пробирки, стаканчики или колбочки на 100 мл,
воронки,
мерные цилиндры на 10 и 50 мл, стеклянные палочки, пипетки на 5 мл,
фарфоровые ступки, выпаривательные чашечки, штативы, скальпели,
бумажные фильтры, этикетки для пробирок, резиновые колечки для прикрепления
этикеток и связывания пробирок, держатели для пробирок, спиртовки, водяная
баня.
Схема исследований
1. Измельченные
зерновки пшеницы на содержание моно - и
дисахаров, крахмала, белков (альбумины,
глобулины, серосодержащие).
2. Измельченные семена гороха на
содержание моно - и дисахаров, крахмала, белков (альбумины, глобулины,
серосодержащие).
3. Мезга
свеклы (желательно сахарной) на
содержание моно – и дисахаров, крахмала,
белков (альбумины, глобулины, серосодержащие).
Методика
исследований
Обнаружение
углеводов. Вначале следует ознакомиться с характером качественных реакций на редуцирующие и нередуцирующие сахара. Для этого необходимо провести
следующие реакции. В одну пробирку внести на конце скальпеля глюкозу, во вторую
и третью - равное количество сахарозы и прилить по 3 мл воды. В третью
пробирку
добавить 2-3 капли 20% НС1, прокипятить 1 мин для
гидролиза
и избыток НС1 нейтрализовать содой до прекращения выделения пузырьков. Затем в
каждую пробирку прилить по 3 мл реактива Фелинга и
поместить их на кипящую водяную баню до образования осадка закиси меди
(на 2-3 мин).
Количество
осадка оценить по 4-балльной шкале. Если оно максимально, а надосадочная жидкость
неокрашена, то оценка наивысшая - 4 балла. Если надосадочная жидкость
слегка голубоватого цвета, значит,
глюкозы недостаточно для полного связывания реактива Фелинга, оценивается в соответствии с
количеством осадка более низким
баллом. Если осадок вообще не образуется и жидкость в пробирке
интенсивно голубого цвета, значит содержание сахара
близко к нулю.
Обнаружение
моно - и дисахаров в растительном материале. По пять граммов мелко
нарезанных корнеплодов или измельченных семян согласно схеме исследования
поместить в колбочки на 100 мл, залить 20 мл воды и нагревать на кипящей водяной бане
5 мин, периодически
взбалтывая. В результате происходит экстракция растворимых сахаров. Полученные
вытяжки следует профильтровать через
увлажненный складчатый фильтр в чистые пробирки, не взмучивая осадка. Из каждой вытяжки в две чистые сухие пробирки налить по 3 мл фильтрата (пробирки можно заранее откалибровать).
В одной из них провести гидролиз дисахаров, как указано выше, затем в каждую добавить равное объему фильтрата количество
реактива Фелинга и
прокипятить все пробирки на водяной бане 5 мин. После этого количество осадка оценить по 4-балльной системе.
Обнаружение
крахмала. К растительной ткани, оставшейся после экстракции сахаров (мезга), добавить
несколько капель йода в йодистом калии и отметить интенсивность окраски по
4-балльной шкале.
Для обнаружения
белка в два стаканчика или колбочки поместить по
С целью
выявления соли и водорастворимого белка к 3 мл фильтрата добавляют 2
мл 20% NaOH или КОН и несколько
капель CuSO4. Последний раствор
надо добавлять очень осторожно, по каплям, так как при его избытке выпадают
голубые хлопья гидроксида меди. При правильно
выполненной реакции образуется прозрачный раствор фиолетового цвета. По
интенсивности окраски раствора
следует сделать вывод о наличии и примерном количестве альбуминов и глобулинов в материале. Оценку провести
по 4-балльной шкале.
Обнаружение серосодержащих белков, в частности, аминокислот - цистеина и цистина.
К раствору белка (3 мл) добавить вдвое больше объема 10 %-ного раствора NaOH и осторожно кипятить 2-3 мин. Затем внести
несколько капель раствора уксуснокислого свинца и продолжать нагревать до выпадения
черного осадка (5 мин.). Отсутствие осадка указывает на отсутствие серосодержащих
белков.
Обнаружение
жиров осуществляют
следующим образом, семянку подсолнечника,
надо предварительно высушить в сушильном шкафу, освободить от оболочки и растереть до порошкообразного состояния. Затем около
Результаты исследований занести в таблицу 12.
|
I.
Вариант II.
Исследования
(культура) |
Углеводы * |
Белки |
||||
|
моносахара |
дисахара |
крахмал |
альбумины |
глобулины |
жиры |
|
|
1. Пшеница |
|
|
|
|
|
|
|
2. Горох |
|
|
|
|
|
|
|
3. Свекла |
|
|
|
|
|
|
·
- +- есть, - нет
На основе данных табл. 12
делают письменное заключение.